用電熱恒溫培養(yǎng)箱做大腸桿菌轉(zhuǎn)化實驗

   粘附在細菌細胞表面的質(zhì)粒DNA在42攝氏度下經(jīng)過短時間的熱擊處理，為DNA的吸收起到促進作用，之后于非選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)一代，等到質(zhì)粒上所帶的抗菌素基因表達，就能夠生長在還有抗菌素的培養(yǎng)基中了。以下就是大腸桿菌轉(zhuǎn)化實驗的具體內(nèi)容。

   實驗目的

1.向大腸桿菌受體細胞內(nèi)導入重組的DNA分子進行復制，增殖以及表達從而獲取目的基因。

2.對大腸桿菌的感受態(tài)細胞效果進行驗證。

3.分子生物學其他研究的使用。

   實驗所需器材

   超凈工作臺，酒精燈，玻璃涂棒，恒溫培養(yǎng)箱，制冰機，恒溫搖床，培養(yǎng)皿（已鋪好固體LB-Amp），1.5ml微量離心管，雙面微量離心管架，干式恒溫氣浴（或恒溫水浴鍋），微量移液取樣器，移液器吸頭，旋渦混合器。

   實驗所需材料和試劑

   無菌ddH2O，20%IPTG（M/V），2%X-gal（M/V，用N,N-二甲基甲酰胺配），培養(yǎng)基（不加抗菌素），LB培養(yǎng)基（加抗菌素），質(zhì)粒DNA，重組DNA，1.5ml離心管裝入鋁制飯盒（滅菌）、移液器吸頭裝入相應的吸頭盒（滅菌）。

   實驗操作步驟

1.首先調(diào)節(jié)恒溫水浴的溫度，將其調(diào)至42℃。

2.將一管（100μl）感受態(tài)菌由零下70℃的超低溫冰柜中取出，立刻使用手指將其加溫融化，然后插入冰中，對其進行5-10分鐘冰浴。

3.將10μl連接產(chǎn)物（通常是全部連接產(chǎn)物，DNA含量大于或等于100ng）加入，輕輕震蕩后放置冰上20分鐘。

4.將其輕輕搖勻后插入42℃水浴中，進行90s的熱休克，然后迅速放回冰中，靜置3-5分鐘。

5.將900μl不含抗菌素的LB培養(yǎng)基分別加入到上述各管中輕輕混勻，之后再搖床的彈簧架上固定，將其在37攝氏度下震蕩30-50分鐘。

6.往含合適抗菌素的固體LB平板培養(yǎng)皿中分別滴加從超凈工作臺中取出的100~300μl上述轉(zhuǎn)化混合液，使用經(jīng)過酒精燈灼燒并且冷卻后的

玻璃涂布棒進行均勻的涂布。

7.若載體和宿主菌對于藍白斑篩選合適的話，那么在滴完菌液后再將8μl20%IPTG，40μl2%X-gal滴加于平板上，使用經(jīng)過酒精燈灼燒并且冷卻后的玻璃涂布棒進行均勻的涂布。

8.標記涂好的培養(yǎng)皿，先放置在37攝氏度電熱恒溫培養(yǎng)箱中30-60分鐘，待表面的液體都滲透到培養(yǎng)基里后，再倒過來放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱過夜。

9.使用酒精對被細菌污染的桌面進行消毒，寫實驗報告。

10.對于平板上長出的菌落克隆進行觀察，如果菌落之間能互相分開，說明實驗結(jié)果好，對于白色菌斑需要特別留意。